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  生长融合率为30%-40%和90%以上的第三代细胞用4预冷的70%冰乙醇固定,4放置24小时。用PBS洗两次;加入RNase 10ug微克和碘化丙锭(PI)0.3毫升,使细胞重悬(4,30分钟)。流式细胞术检测FL2红色荧光。用Modfit LT 2.0软件分析细胞周期。

  从每个样品中取出两个样品,分别用同型抗体标记作为阴性对照和待测,并分别加入106个细胞/100微升待测细胞。将荧光标记的单克隆抗体CD29和CD44作为阴性对照加入到同类型对照试管中,加入荧光标记的单克隆抗体CD29 PE和CD44 PE作为实验试管,各20 ul,混匀。室温避光孵育30分钟,加入2 ml PBS,以1 200 r/min离心10分钟,弃去上清液,控制干燥,加入0.5ml固定液(染色缓冲液)。

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先测试同型对照,再测试实验管。软件采集数据,分析阳性细胞比例。

  (2)脂肪干细胞的制备:用于靶基因转染的细胞

  ,其生长状态如何,将直接决定了基因转染效率。如为贴壁生长的细胞,一般要求在转染前一日,必需应用胰酶处理成单细胞悬液,重新接种于培养皿或瓶,细胞密度以铺满培养器皿的60%为宜,转染当日,在转染前4小时换一将近新鲜培养液。对于悬浮细胞,也需在转染前4小时换一次新鲜培养液。

  G418筛选要做预试验确定最佳浓度,将细胞稀释至1 000 cell/ml,每孔100 ul加入有培养基的24孔板,将每孔中的G418浓度稀释至0,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900,1 000,1 100 ng/ml等12个级别, 培养10-14天,以最低细胞全部死亡浓度为基准,一般400-800左右,筛选时比该浓度再高一个级别,维持使用筛选浓度的一半。

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  悬浮细胞复苏后培养2.3天会出现小黑点,在倒置显微镜第四挡可见细菌在活动。采用两次离心,然后加平时双倍量的抗生素,效果不佳。实验用的东西都重新高压灭菌了,培养液也重新过滤了,个人操作也更加注意了,但仍然在复苏后出现细菌,苦恼!!!

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  Last date of menstrual cycle末次来月经日期:…………………………..

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  Conclusion结论:

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